專(zhuān)家點(diǎn)評Nature背靠背 |浙大教授解釋基因敲除為何沒(méi)有表型
發(fā)布時(shí)間:
2019-07-18
Robustness指一個(gè)復雜系統適應和應對內部和外界擾斷而行使正常功能的能力。遺傳系統健壯性（genetic robustness）指一個(gè)生命體能緩沖基因組中有害突變的能力。突變是生命進(jìn)化的原動(dòng)力，而有害突變是致死。一個(gè)穩定的遺傳系統既能緩沖突變同時(shí)進(jìn)行世代更迭，這樣本體能維持正常功能，突變在代際間傳遞和累積給予了生物系統進(jìn)化發(fā)展的空間【1】。遺傳穩定性可由多種機制介導：1. 遺傳冗余基因（genetic redundancy）可替代失活基因行使正常功能；2. 遺傳網(wǎng)絡(luò )的重整（rewiring genetic network）也可以應對變化/擾動(dòng)；3. 酵母中發(fā)現了適應突變（adaptive mutations: 相應突變來(lái)應對致死突變而得以生存）【2】。
015年，德國馬普學(xué)會(huì )Didier Stainier教授報道斑馬魚(yú)中一種遺傳補償效應（genetic compensation）【2】。斑馬魚(yú)中，科學(xué)家使用Morpholino來(lái)阻斷mRNA翻譯進(jìn)行基因功能缺失的研究。Stainier教授用Morpholino阻斷基因egfl7的翻譯，觀(guān)察到血管網(wǎng)絡(luò )系統異常。而當他們檢測egfl7基因的一種缺失突變時(shí)，該突變體卻一切正常沒(méi)有與Morpholino實(shí)驗相似的表型！進(jìn)一步實(shí)驗表明該缺失突變體中egfl7基因RNA水平極低，但與之功能相似并序列同源的emilin系列基因表達上升，出現了轉錄水平的適應（adaption）反應，這些基因的表達補償了egfl7功能的缺失。遺傳補償效應只在這種缺失突變體觀(guān)察到（圖1）。顯性失活（dominant negative）突變體、morpholino處理，以及CRISPR技術(shù)阻斷轉錄延長(cháng)實(shí)驗均不能進(jìn)行遺傳補償。在多個(gè)基因，在老鼠和擬南芥中均發(fā)現了這種現象，表明遺傳補償是一種普遍的現象，但分子機制不清楚。
圖1 TALEN造成egfl基因第三個(gè)外顯子3/4bp的缺失，形成了egfl7 mRNA在氨基酸第49位提前終止密碼子。
2019年4月4日，Nature背靠背在線(xiàn)發(fā)表了浙江大學(xué)陳軍教授和Stainier教授的研究成果，揭示了遺傳補償效應的分子機制。研究表明這些沒(méi)有表型的基因突變均可轉錄產(chǎn)生無(wú)義mRNA，無(wú)義mRNA引起相應降解（non-sense mRNA mediated decay，NMD）。介導NMD的Upf3a蛋白可以和COMPASS復合物直接作用，激活同源基因的表達，進(jìn)行功能補償。這是首次發(fā)現基因突變產(chǎn)生的無(wú)義mRNA降解直接介導對同源基因位點(diǎn)進(jìn)行表觀(guān)遺傳調控，激活其表達。
這一分子機制的闡明將有助于我們理解遺傳操作實(shí)驗的一些看似相悖的結果，同時(shí)提供一種全新的思路解釋和治療人類(lèi)的某些遺傳病（見(jiàn)專(zhuān)家點(diǎn)評）。陳軍教授的研究在斑馬魚(yú)中完成，Stainier教授同時(shí)進(jìn)行了斑馬魚(yú)和老鼠的實(shí)驗。下面將主要解讀陳軍教授的實(shí)驗。
斑馬魚(yú)中，Morpholino抑制capn3a基因功能造成肝臟縮小，而capn3a一個(gè)14bp缺失突變體（Δ14）卻表型正常。該缺失突變體造成氨基酸第60位沉默突變即一個(gè)提前終止密碼子，capn3 mRNA水平也非常低，顯示是一個(gè)完全功能缺失突變。作者同時(shí)檢測19個(gè)capn3同源基因發(fā)現有共計10個(gè)同源基因的mRNA水平升高，capn8和capn12的表達增加最多（圖2），但是Morpholino組沒(méi)有這些基因表達升高。作者推測是無(wú)義mRNA降解（NMD）引起的。為了驗證推測，作者繼續構建了多個(gè)capn3基因不同位點(diǎn)的沉默突變，可能引起NMD。實(shí)驗表明，不同位點(diǎn)的沉默突變可有不同的補償效果。有75%位點(diǎn)的沉默突變沒(méi)有肝臟縮小表型，激活了同源基因的表達。這一補償效應有序列特異性，只引起同源基因的表達升高。capn3無(wú)義RNA不能引起別的基因的表達上升。同時(shí)capn3a轉錄本水平越低，同源基因的表達越高。進(jìn)一步分析顯示，補償效應的產(chǎn)生需要這些無(wú)義RNA的轉錄和翻譯，進(jìn)一步提示了NMD的存在。
圖2 capn3a缺失突變的無(wú)義RNA降解造成capn8和capn12基因表達升高，進(jìn)行遺傳補償。
無(wú)義mRNA降解（NMD）由Upf1，Upf2和Upf3蛋白結合在外顯子連接部位，觸發(fā)RNA降解。Upf3b活躍參加介導了NMD，而在其他研究中upf3a沒(méi)有NMD作用，甚至顯示相反效果。本文構建了upf3a（-）；capn3a（Δ14）雙缺失突變體，斑馬魚(yú)呈現了capn3a功能缺失的肝臟縮小表型，沒(méi)有了遺傳補償，揭示了upf3a介導了遺傳補償效應。
COMPASS復合物（complex of proteins associated with Set1）可對轉錄起始位點(diǎn)（TSS）進(jìn)行組蛋白H3K4的三甲基化，激活基因轉錄起始。upf3amorpholino對capn3a（Δ14）胚胎處理后，可見(jiàn)在capn8和capn12基因TSS位點(diǎn)組蛋白H3K4的三甲基化水平的降低。Upf3a蛋白可和COMPASS復合物Wdr5蛋白直接作用，并和Rbbp5蛋白發(fā)生聯(lián)系，形成Upf3a-Wdr5-Rbbp5的復合物，激活基因轉錄。Morpholino阻斷wdr5功能，可抑制遺傳補償效應，表明COMPASS復合物在遺傳補償作用中是必需的。
Stainier教授文中還提到了一個(gè)有趣的現象，轉染相應基因的短RNA片段同樣可以上調該基因的表達。更近一步，降低基因反義RNA （antisense transcript）具有相同的效果。這預示著(zhù)基因轉錄可以同時(shí)影響基因表觀(guān)遺傳水平的調控。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1057-y
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1064-z
參考文獻：
1. Kitano, H. Biological robustness，Nature Reviews Genetics, 5:827 (2004)
2. Rossi, A. et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature ,524:230 (2015).
專(zhuān)家點(diǎn)評：
孫永華（國家斑馬魚(yú)資源中心主任）
遺傳補償是指機體中特定基因發(fā)生功能喪失型的序列突變后，導致該基因家族的其他成員表達上調，從而彌補特定基因功能的遺傳學(xué)現象。遺傳補償現象廣泛存在于動(dòng)植物，如擬南芥、斑馬魚(yú)、小鼠甚至是人類(lèi)中，被認為是生物在進(jìn)化中為了應對基因突變而產(chǎn)生的遺傳耐受，其通常發(fā)生于基因敲除而非基因敲降個(gè)體中。近年來(lái)，隨著(zhù)基因組編輯技術(shù)的迅速發(fā)展，利用反向遺傳學(xué)手段系統構建突變體研究基因的在體功能成為可能，然而出乎意料的是眾多基因的突變并不會(huì )導致明顯的表型缺陷。例如，在斑馬魚(yú)中，超過(guò)80%的基因突變并不會(huì )出現明顯的表型。因此，學(xué)術(shù)界對遺傳補償的關(guān)注度越來(lái)越高。這兩篇發(fā)表于Nature的論文利用斑馬魚(yú)或小鼠培養細胞模型，在不同的層面闡釋了誘發(fā)遺傳補償效應的可能的分子機制。
德國馬普研究所Didier Y. R. Stainier實(shí)驗室詳細論證了無(wú)義介導的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）對誘發(fā)遺傳補償的重要性：干擾NMD途徑的重要因子upf1的表達會(huì )降低遺傳補償效應；在野生型胚胎中過(guò)表達未加冒的RNA（這種RNA在體內會(huì )快速被5’-3’核酸內切酶降解）會(huì )導致遺傳補償效應的出現；缺失基因的啟動(dòng)子區或整個(gè)基因座位（沒(méi)有突變mRNA的降解）并不會(huì )導致遺傳補償效應。同時(shí)，他們的研究發(fā)現發(fā)生補償的基因通常與突變mRNA具有高度的序列相似性，且補償基因的高表達與其轉錄起始位點(diǎn)處的組蛋白H3K4me3修飾有關(guān)。
更進(jìn)一步，浙江大學(xué)陳軍實(shí)驗室和彭金榮實(shí)驗室合作發(fā)現，當且僅當轉錄的mRNA攜帶提前終止密碼子（premature termination codon，PTC）才會(huì )誘導遺傳補償效應，如果突變位點(diǎn)位于基因的最后一個(gè)外顯子則不會(huì )誘發(fā)遺傳補償，非常有意思的是他們還證明只有攜帶PTC和同源序列的轉基因才能激活體內同源基因的表達，而注射體外合成的mRNA并不具備這樣的功能。他們的研究進(jìn)一步發(fā)現，介導NMD的upf1或upf3b都不參與遺傳補償效應的產(chǎn)生，而同家族的upf3a直接參與誘導遺傳補償效應：Upf3a蛋白結合在攜帶PTC的無(wú)義mRNA上，招募Wdr5-COMPASS復合體至同源基因的轉錄起始區域，促進(jìn)核小體H3K4位的3甲基化，激活同源基因的表達，從而產(chǎn)生遺傳補償。如果無(wú)義mRNA與Upf3b結合，則會(huì )招募Upf2和Upf1使無(wú)義mRNA進(jìn)入NMD途徑。
這兩份工作分別從NMD發(fā)生和無(wú)義 mRNA產(chǎn)生的角度，揭示了遺傳補償效應發(fā)生的可能分子機制。它們的共同點(diǎn)在于：1) 均強調無(wú)義mRNA對于遺傳補償發(fā)生的必要性；2)發(fā)生補償的基因通常與突變RNA具有序列相似性；3)補償基因的激活表達與其轉錄起始序列處的H3K4me3修飾相關(guān)。不同點(diǎn)在于，浙大工作認為無(wú)義突變mRNA并非只是簡(jiǎn)單地被NMD途徑降解，部分無(wú)義突變mRNA會(huì )與Upf3a招募COMPASS復合體，激活同源基因的表達。
遺傳補償的分子機制的揭示對于如何阻斷遺傳補償以研究基因功能，或者激活遺傳補償以實(shí)現對突變導致的遺傳疾病的治療均提供了全新的思路。例如為了更好地研究基因功能，通過(guò)敲除啟動(dòng)子區阻斷突變RNA轉錄，或針對編碼重要功能域的最后一個(gè)外顯子創(chuàng )造突變，都可以有效地避免遺傳補償效應；另一方面，通過(guò)敲除/敲降upf3a也可以阻斷遺傳補償等。對于錯義突變所導致的遺傳疾病的治療，則可以考慮在突變基因中人為制造PTC或轉基因引入PTC來(lái)誘發(fā)機體產(chǎn)生遺傳補償，從而達到基因治療的目的。
總之，遺傳補償分子機制的發(fā)現具有重大科學(xué)意義。當然，這一領(lǐng)域仍然有一些亟待回答的科學(xué)問(wèn)題。例如，在同一基因家族的多個(gè)成員間，發(fā)生遺傳補償是否具有基因或序列特異的選擇性？為什么有些無(wú)義mRNA突變會(huì )導致遺傳補償，另一些突變又不導致補償效應？是否存在過(guò)度遺傳補償，以及什么情況下可能出現過(guò)度補償的效應？
徐鵬飛（浙江大學(xué)醫學(xué)院，百人計劃研究員）
對于一些尚沒(méi)有胚胎干細胞（ESCs）系的模式生物如斑馬魚(yú)等來(lái)說(shuō)，利用同源重組的方法建立基因敲除模型一直是一項困難的任務(wù)，因此Morpholino（是把核苷酸上的五碳糖環(huán)用一個(gè)嗎菲林（morpholino）取代，同時(shí)對磷酸基團也做了改變，使其可以以堿基配對的方式與體內的目的基因mRNA 結合，抑制蛋白翻譯，達到瞬時(shí)敲低基因表達的目的，在斑馬魚(yú)、爪蟾和雞胚等模式生物中得到廣泛應用）等基因敲低技術(shù)一直是一種簡(jiǎn)便快捷的研究基因功能的手段，直到TALEN、Crispr-Cas9等基因編輯技術(shù)的出現，人們終于可以在斑馬魚(yú)等模式生物中高效的實(shí)現基因敲除，建立小鼠基因敲除模型的效率也大大提高了。大家在為之興奮的同時(shí)，很多實(shí)驗室（尤其是斑馬魚(yú)實(shí)驗室）都多多少少遇到了相同的問(wèn)題：基因敲除模型與Morpholino敲低模型不一致，甚至敲低表型在基因敲除模型中徹底消失。這個(gè)問(wèn)題造成了很大的困擾：這種現象是因為Morpholino的脫靶效應引起的？難道之前很多的基因敲低工作都是錯的？抑或是在遺傳水平上完全缺失某些基因啟動(dòng)了全新的機制所導致？
針對這些問(wèn)題，科學(xué)家們進(jìn)行了深入的探索，之前已有一些工作表明遺傳敲除某些基因會(huì )啟動(dòng)某種代償機制，對缺失的基因，其同源基因會(huì )在突變體中的表達量上調，從而補償其功能，而達到維持機體正常生理功能的目的【1,2】！但其機制并未闡明。
4月4日Nature在線(xiàn)背靠背發(fā)表的來(lái)自浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的陳軍老師和彭金榮老師實(shí)驗室的工作，和來(lái)自德國馬克普朗克研究所的Didier Stainier實(shí)驗室的工作分別對其機制進(jìn)行了研究【3,4】。陳軍、彭金榮老師研究組首先針對capn3a和nid1a兩個(gè)基因，用一系列漂亮的突變體結合轉基因斑馬魚(yú)系證明了基因突變導致的遺傳補償機制（Genetic Compensation Response，GCR）是依賴(lài)于突變所造成的蛋白翻譯未成熟提前終止信號（premature termination codon，PTC），這種提前終止會(huì )導致突變基因的同源基因上調，從而導致敲低capn3a導致的肝臟變小以及nid1a敲低所導致的體長(cháng)變短兩個(gè)表型在其各自的突變體中消失；進(jìn)一步的研究證明該補償機制依賴(lài)于Upf3a蛋白介導的一種存在于真核生物中重要的RNA監控機制- “無(wú)義介導的mRNA降解”信號通路（nonsense-mediated mRNA decay，NMD），但并不依賴(lài)于同樣參與NMD的Upf1和Upf3b，有意思的是，Upf3a介導的基因代償，并非使突變mRNA降解，相反的，是保護其不被降解（這與同期發(fā)表的另一篇文章的機制正好相反）；陳、彭研究組進(jìn)一步證明，Upf3a誘導遺傳補償的機制是其與COMPASS復合體結合，從而增加相關(guān)同源基因在轉錄起始位點(diǎn)附近的H3K4三甲基化水平，而最終使這些基因的轉錄水平上調（下圖），而被保護的突變基因可能起到識別、并招募Upf3a及COMPASS復合體至其同源基因轉錄起始位點(diǎn)附近的作用。
同期背靠背發(fā)表的另一篇文章利用斑馬魚(yú)和小鼠模型，同樣闡明了PTC介導的依賴(lài)于NMD的基因代償機制，同樣需要COMPASS介導的H3K4三甲基化參與，最大的不同是，Stainier組所闡述的機制依賴(lài)于突變mRNA的降解，而不是保護（下圖），可能的原因是否是因為不同的組織所利用的遺傳代償機制有所不同？（前一篇文章兩個(gè)基因分別影響肝臟和體長(cháng)發(fā)育，后一篇文章主要關(guān)注了細胞的形態(tài)和斑馬魚(yú)血管）
綜上所述，這兩篇文章解決了困擾很多研究組的一個(gè)難題，為辛辛苦苦獲得了突變體而發(fā)現表型沒(méi)了的實(shí)驗室重新帶來(lái)了希望，因此相信一段時(shí)間內陳、彭老師的Upf3a突變體會(huì )非常搶手。另外，像這兩篇文章中提到的，這也許可以為基因突變所導致的一些疾病帶來(lái)新的治療策略，同時(shí)，這兩篇文章也引出了一些很有意思的問(wèn)題，如：COMPASS在特定基因的突變體中如何實(shí)現特異性的識別其同源基因的，突變mRNA如何識別其同源基因的轉錄起始位點(diǎn)？是否有更多的表觀(guān)遺傳調控機制參與？以及為什么只有部分基因存在代償機制，該代償機制是否存在細胞或組織特異性等。
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