CRISPR/Cas系統是細菌和古細菌抵抗外源遺傳物質(zhì)感染而演化出的一種獲得性防御機制。CRISPR全稱(chēng)Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats，翻譯為規律成簇的間隔短回文重復序列；Cas指的是CRISPR關(guān)聯(lián)（CRISPR-associated）蛋白。當病毒或外源質(zhì)料侵入時(shí)，細菌通過(guò)將這些外源DNA整合到自身基因組而產(chǎn)生免疫“記憶”；當再次遭受入侵時(shí)，細菌CRISPR-Cas系統可以特異性地識別出相應的外源DNA，將它們切斷，沉默外源基因的表達。正是由于這種精準的靶向特性，CRISPR/Cas系統業(yè)已被改造成一種強大的基因組編輯和調控工具。目前已經(jīng)鑒別出多種類(lèi)別的CRISPR/Ca（Type I-VI）系統，其中II型CRISPR/Cas9系統的研究最為深入，得到了諸多方面的應用。CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸內切酶（ZFN）和類(lèi)轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）之后的第三代基因組編輯技術(shù)。憑借操作方便、成本低廉、靶向高效等優(yōu)勢，CRISPR/Cas9技術(shù)迅速風(fēng)靡基因編輯領(lǐng)域，有望為治療一些人類(lèi)重大遺傳疾病及癌癥帶來(lái)希望。

 

核酸內切酶Cas9是II型CRISPR系統的基因“剪刀手”，它通過(guò)與引導RNA（gRNA）形成核糖核蛋白復合物（RNP）而發(fā)揮靶向和剪切功能。僅僅通過(guò)改變引導RNA的前20個(gè)核苷酸序列，原則上Cas9 RNP就可以選擇性識別并作用于任何基因位點(diǎn)。2012年，Jennifer Doudna和 Emmanuelle Charpentier研究團隊在Science上首次報道了化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9（記為SpCas9或SpyCas9）在體外具有剪切DNA的活性。根據Google Scholar統計顯示，截止2019年8月，該研究論文已經(jīng)被引用近7300次（Doudna和Charpentier因此成為諾獎熱門(mén)人選）。盡管來(lái)自其它物種的Cas9蛋白相繼被鑒別出來(lái)，基于SpyCas9開(kāi)發(fā)的基因編輯工具目前在全球生物實(shí)驗室和生物技術(shù)公司中仍然受到最為廣泛的應用，這在一定程度上得益于對該蛋白結構與功能機理的持續解析。

 

Cas9包含兩個(gè)稱(chēng)之為HNH和RuvC的核酸酶結構域，其活性依賴(lài)于鎂離子。這兩個(gè)結構域好比兩把剪刀，分別將DNA兩條鏈剪開(kāi)，從而形成雙鏈缺口。HNH負責切割與RNA引導序列互補的DNA鏈（即靶DNA鏈），另一條被置換的DNA鏈（即非靶DNA鏈）則由RuvC完成剪切。就SpyCas9而言，處于不同構象狀態(tài)的結構相繼被解析出來(lái)，包括無(wú)核酸結合的apo態(tài)、僅結合引導RNA的狀態(tài)、結合非完整DNA的狀態(tài)及結合R-loop的狀態(tài)。RuvC剪切非靶DNA鏈的活性構象及相關(guān)催化機理基本被簡(jiǎn)明。相比之下，HNH與靶DNA鏈形成的活性構象及參與催化的關(guān)鍵殘基仍然存在很大的爭議。其中，H840作為廣義堿（general base）的功能已經(jīng)得到證實(shí)。此外，生化實(shí)驗表明N863也對剪切靶DNA鏈至關(guān)重要。但令人十分費解的是，在所有通過(guò)結構或計算手段獲得的處于結合狀態(tài)的SpyCas9結構中，殘基N863明顯位于HNH活性中心之外，與之毗鄰的D861卻朝向靶DNA鏈剪切位點(diǎn)【1-3】。如果僅從結構上推斷，D861似乎是一個(gè)關(guān)鍵殘基，但缺乏實(shí)驗支持。除此之外，其它報道的可能直接參與催化的殘基有D837，D839和N854。因此，解析SpyCas9與靶DNA形成的處于剪切狀態(tài)的復合物結構無(wú)疑將有助于闡釋這些看似矛盾的結構與功能數據。

 

近日，美國University of North Texas Health Science Center 劉瑾教授課題組與合作者在eLife上發(fā)表題為Structural and functional insights into the bona fide catalytic state of Streptococcus pyogenes Cas9 HNH nuclease domain的文章。該研究結果以Short Reports形式在線(xiàn)發(fā)表，并被編輯選入eLife digests。通過(guò)綜合運用各種計算模擬方法和體外以及基于細胞的功能實(shí)驗，作者從原子和分子水平上揭示并驗證了SpyCas9 HNH核酸酶結構剪切靶DNA鏈的催化構象。

 

 

研究表明SpyCas9 HNH結構域“?？俊钡桨蠨NA鏈可采取兩種不同構象狀態(tài)中的一種?；贜863在HNH結構域ββα催化元件上的不同取向，作者將兩種構象分別稱(chēng)為N863-OUT和N863-IN。N863-OUT構象見(jiàn)于先前報道之中，但實(shí)際上并不具有剪切能力。當轉變?yōu)镹863-IN構象狀態(tài)時(shí)，HNH結構域能夠巧妙地利用D839-H840-N863三殘基組合行使剪切靶DNA鏈的功能。進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬和自由能計算表明N863-OUT比N863-IN狀態(tài)更為穩定，這解釋了為什么實(shí)驗結構常常捕獲到前者構象狀態(tài)。

 

 

幾乎在同期，來(lái)自美國和加拿大的課題組運用冷凍電鏡技術(shù)獲得了Cas9 RNP結合DNA所形成的處于不同剪切階段的復合物結構【4】。這些結構分別對應構象校驗點(diǎn)（conformational checkpoint）狀態(tài)（先前其它課題組已經(jīng)報道過(guò)）、剪切后（post-cleavage）狀態(tài)、以及產(chǎn)物（product）狀態(tài)。他們的研究結果于7月8日在線(xiàn)發(fā)表在Nature Structural &Molecular Biology上，題為Cryo-EM structures reveal coordinateddomain motions that govern DNA cleavage by Cas9。該研究同樣表明SpyCas9利用D839-H840-N863三殘基催化靶DNA水解，盡管并沒(méi)有輔以功能實(shí)驗進(jìn)行驗證。

 

總之，這兩項獨立工作相互補充，互相驗證，從不同角度和不同層次上清楚地展示了SpyCas9 HNH核酸酶結構剪切靶DNA鏈的活性構象，消除了先前對HNH結構域在結構-功能關(guān)系認識上的分歧。所獲得的新的結構信息將有助于合理優(yōu)化SpyCas9的靶向特異性和催化活性。據了解，Dr. Jin Liu組據此已經(jīng)設計出若干種新型突變體蛋白，初步實(shí)驗表明它們在不同程度上降低了脫靶效應，后續工作正在進(jìn)展之中。

 

據悉，上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院左志成副教授為論文的第一作者，University of North Texas Health Science Center藥學(xué)院Dr. Jin Liu和Dr. Yu-Chieh Wang為論文的共同通訊作者。另外，美國University of Oklahoma Dr.Rakhi Rajan課題組在論文修改的過(guò)程提供了額外的實(shí)驗支持。

 

原文鏈接：

https://elifesciences.org/articles/46500

 

制版人：小嫻子

 

 

參考文獻

 

1. Palermo G, et al. CRISPR-Cas9conformational activation as elucidated from enhanced molecular simulations. Proceedings of the National academy ofSciences of the United States of America 114: 7260-7265 (2017)

2. Zuo Z, and Liu J. Structure and Dynamicsof Cas9 HNH Domain Catalytic State. ScientificReports 7: 17271 (2017)

3. Huai C, et al. Structural insights into DNA cleavage activation ofCRISPR-Cas9 system. Nature Communications8: 1375 (2017)

4. Zhu X, et al. Cryo-EM structures revealcoordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. NatureStructural & Molecular Biology 26: 679–685 (2019)