作為最先進(jìn)、最熱門(mén)的基因編輯技術(shù)，CRISPR-Cas9技術(shù)被廣泛用于編輯哺乳動(dòng)物細胞的基因組，具有非常巨大的臨床應用潛能。目前，CRISPR為基礎的療法已經(jīng)開(kāi)始臨床試驗（NCT03655678、NCT03399448），以研究其安全性和可行性，但試驗的結果還沒(méi)有報道。
同種異體移植天然攜帶CCR5突變的造血干細胞和祖細胞（HSPCs）能夠長(cháng)期根除HIV-1，CCR5是HIV入侵的關(guān)鍵共受體。10年前，曾有一位感染了HIV-1的“柏林患者”通過(guò)造血干細胞移植治療急性髓系白血病，而供體細胞恰具有CCR5Δ32/Δ32 突變，骨髓移植后，患者的HIV得到長(cháng)期緩解【1】。但是當時(shí)那個(gè)單一的病例并不能反映到底哪種治療手段或患者因素是緩解HIV的原因，畢竟骨髓移植手術(shù)還需要進(jìn)行全身輻射。
10年后的2019年3月6日，來(lái)自英國倫敦大學(xué)學(xué)院、劍橋大學(xué)等處的科學(xué)家在Nature發(fā)表的一篇題為HIV-1 remission following CCR5Δ32/Δ32 haematopoietic stem-cell transplantation 的論文【2】，報告世界上第二例經(jīng)干細胞移植后HIV-1感染得以緩解的病例。截止到論文發(fā)表的時(shí)間為止，患者的病情已經(jīng)緩解了18個(gè)月，但是作者提醒，要說(shuō)患者的艾滋病已經(jīng)“被治愈”還為時(shí)尚早。
因此移植人為突變CCR5的細胞或許是抵抗HIV-1感染的替代性療法。2017年8月，北京大學(xué)鄧宏魁教授實(shí)驗室聯(lián)合307醫院陳虎實(shí)驗室發(fā)展出一種無(wú)病毒的CRISPR基因組編輯系統【3】，在人HSPCs中突變CCR5，效率達到27%；而且在小鼠模型中顯示，CCR5突變的HSPCs能夠在小鼠中重建人類(lèi)免疫系統，抵抗HIV-1感染。那么CCR5編輯的HSPCs在人體內是否能夠抵抗HIV感染，其安全性和有效性又是如何呢？
2019年9月11日，鄧宏魁教授、307醫院的陳虎教授（解放軍總醫院第五醫學(xué)中心全軍造血干細胞研究所所長(cháng)、教授，軍事醫學(xué)研究院原附屬醫院造血干細胞移植科主任醫師，2019年7月24日20時(shí)50分在北京因病不幸逝世，享年57歲）以及北京佑安醫院吳昊教授研究組合作在The New England Journal of Medicine雜志上發(fā)表文章CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia，報道了首例利用CRISPR-Cas9在HSPCs中編輯CCR5基因并成功移植到罹患HIV和急性淋巴細胞白血病的患者案例，移植治療使病人的急性淋巴白血病得到完全緩解，攜帶CCR5突變的供體細胞能夠在受體體內長(cháng)期存活達19個(gè)月，初步探索了該方法的可行性和安全性，但比例僅有5%，需要進(jìn)一步優(yōu)化治療方法?？梢灶A見(jiàn)的是，該臨床試驗報告將會(huì )推動(dòng)全球范圍內基于CRISPR基因編輯手段用于臨床治療，其意義不言而喻。
據文中報道，該病人為27歲男性，在2016年5月14日和5月30日分別診斷患有HIV-AIDS和急性淋巴細胞白血病（T細胞型）。隨后立即接受抗逆轉錄病毒治療，1年后HIV感染得到控制，在血清中檢測不到病毒RNA。病人接受6個(gè)療程標準的化療治療后，其形態(tài)上達到完全緩解。供體細胞來(lái)自中華骨髓供體庫的一名33歲男性，其HLA配型完全匹配，CCR5基因沒(méi)有突變。2017年7月9日，病人在清髓后，接受異體干細胞移植。干細胞移植的細胞由兩部分組成：動(dòng)員后外周血單核細胞分離出CD34+HSPCs，接受CRISPR編輯CCR5基因；剩下的單核細胞（由于分離效率，有部分CD34+細胞，占總CD34+細胞的28.8%，也就是說(shuō)71.2%的CD34+被分離出來(lái)進(jìn)行了基因編輯）。病人同時(shí)接受抗逆轉錄病毒治療、移植物抗宿主病預防用藥。
移植治療后，13天和27天分別出現中性粒細胞和血小板重建；淋巴細胞和T細胞亞群增加，CD4細胞在6個(gè)月時(shí)恢復到正常范圍并穩定；3個(gè)月時(shí)，血小板出現短暫減少，隨后自行恢復到正常范圍并穩定；4周后，實(shí)現了完全的供體嵌合，并維持到了19個(gè)月。移植后4周，病人的急性淋巴白血病達到形態(tài)上的完全緩解，并維持到隨訪(fǎng)的19個(gè)月。
利用非病毒方式轉染CRISPR-Cas9對HSPCs（CD34+）細胞進(jìn)行基因編輯，基因測序結果顯示CCR5發(fā)生插入和刪除突變（indel）的效率是17.8%。由于CD34+細胞分離效率限制，19個(gè)月長(cháng)期的重建過(guò)程中，CCR5突變在骨髓有核細胞的比例范圍是5.20%到8.28%。CCR5突變比率顯示CD19+、CD33+、CD235a+細胞的編輯效率略高，CD4+、CD8+細胞稍低。結果顯示，CRISPR編輯的HSPCs成功在病人體內重建，能夠分化成多種譜系細胞，并保持基因編輯狀態(tài)。
移植治療過(guò)程中，病人出現2～3度的造血干細胞移植常見(jiàn)的并發(fā)癥，經(jīng)常規治療后都得到緩解；沒(méi)有發(fā)現與CCR5基因編輯相關(guān)的副作用事件。利用高通量基因測序技術(shù)檢測基因編輯的脫靶效應，經(jīng)過(guò)綜合排查，僅有14個(gè)位點(diǎn)檢測出Indels，且僅有1bp的突變，經(jīng)逐個(gè)分析考慮并不是真正的脫靶事件。收集移植后15周、12個(gè)月、19個(gè)月的骨髓血樣本，全基因組測序檢測并無(wú)脫靶效應，而且沒(méi)有染色體重排或長(cháng)片段刪除。
之前的研究顯示自體移植CCR5突變T細胞能夠在中斷抗病毒治療期間，降低病人體內的病毒載量【4】，提示CCR5刪除突變或許能替代長(cháng)期使用抗逆轉錄病毒療法。研究人員對CCR5編輯HSPCs能否抵抗HIV-1感染進(jìn)行測試。經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì )批準及病人的同意后，暫時(shí)中斷抗逆轉錄病毒治療，4周時(shí)血清中病毒載量增加到3*107/ml；恢復藥物治療后，病毒載量降低?？鼓孓D錄病毒治療中斷期間，外周血CD4+細胞降低，CD4/CD8比例降低；CD4+細胞中CCR5突變的比例有所增加。移植6個(gè)月后，CD4+細胞恢復至正常范圍。移植8個(gè)月和19個(gè)月后，檢測外周血樣本發(fā)現HIV病毒的噬性并沒(méi)有發(fā)生改變（依然為CCR5噬性）。
總的來(lái)說(shuō)，本文報道了一例利用CRISPR編輯CCR5的HSPCs干細胞移植治療罹患HIV和急性淋巴白血病病人的案例。研究人員利用一種新型的非病毒轉染方式高效率地編輯CCR5基因，編輯的干細胞能夠分化成多種譜系細胞，且保留CCR5編輯效果，維持達19個(gè)月；本次干細胞移植治療使病人的急性淋巴白血病得到形態(tài)上完全緩解，另外也并沒(méi)有出現明顯的編輯后副反應，但對抵制HIV感染效果欠佳，需要進(jìn)一步探索。
值得一提的是，鄧宏魁教授正是CCR5的發(fā)現者。在1996年發(fā)表的一篇Nature文章中【5】，鄧宏魁教授在紐約大學(xué)從事博士后研究時(shí)（1995-1997年）作為第一作者發(fā)現了CC-CKR-5（即CCR5），該研究是HIV領(lǐng)域內里程碑式的發(fā)現。目前該文章已被引用超過(guò)4300次。
值得一提的是，NEJM同期還發(fā)表了美國科學(xué)院院士、賓夕法尼亞大學(xué)終身教授Carl H. June撰寫(xiě)的題為Emerging Use of CRISPR Technology — Chasing the Elusive HIV Cure的評論。評論認為“該工作的安全狀況似乎是可以接受的，盡管相關(guān)數據僅限于該病例研究。值得注意的是，為了確保方法的安全性，需要更長(cháng)時(shí)間對病人進(jìn)行隨訪(fǎng)。一個(gè)令人矚目的方面是，本研究報告將基礎研究快速轉化成為了臨床1期試驗。而在賓夕法尼亞大學(xué)，從動(dòng)物實(shí)驗概念證實(shí)到人的臨床試驗需要5年，而在本研究中只用了2年。”此外，Carl H. June對媒體還表示，“該研究對相關(guān)領(lǐng)域來(lái)說(shuō)非常好，而且沒(méi)有引發(fā)倫理上的擔憂(yōu)”。
https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1817426?query=featured_homehttps://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMe1910754
張林琦（清華大學(xué)艾滋病綜合研究中心主任）
自從1981年艾滋病的發(fā)現，1983年艾滋病病毒(HIV)被分離并確定為艾滋病病原體的三十多年以來(lái)，我們對HIV生物學(xué)和人體抗HIV免疫應答開(kāi)展了系統的研究，研發(fā)成功多種抗HIV藥物。這些藥物的優(yōu)化組合（雞尾酒療法）能夠有效抑制HIV的復制，為降低艾滋病患者的死亡率，降低HIV傳播，提高感染者的生活質(zhì)量起到了關(guān)鍵性的作用，使一種為早期醫學(xué)宣判為死刑的疾病轉為一種可治療和可控制的慢性疾病。但目前使用的這些抗HIV藥物，仍然無(wú)法把HIV從體內根本清除。其主要原因是HIV的高度變異和潛藏在人體的細胞內，巧妙地躲過(guò)了人體免疫系統和抗HIV藥物的識別，對治愈艾滋病提出了嚴峻的挑戰。
當前，在艾滋病治愈的研究領(lǐng)域，活躍著(zhù)三個(gè)主要的研究方向和策略。第一是潛藏庫的清除，其中如何特異識別和激活潛藏庫，并加以抑制和殺傷，是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。第二是利用多種免疫學(xué)手段，提高感染者抗病毒免疫水平，最終達到有效控制和徹底清除病毒的目標。主要包括廣譜中和抗體、多種免疫細胞（CART，TCRT，CAR-NK等）、免疫因子和治療性疫苗的研究。第三是基因治療，利用近幾年逐步完善的基因編輯技術(shù)，比如ZFN，TALEN和CRISPR/Cas9等，開(kāi)展對艾滋病病毒靶細胞的基因修飾，特別是對T淋巴細胞和造血干細胞等體細胞第二受體CCR5基因的定點(diǎn)敲除，建立能夠抵抗艾滋病病毒感染的細胞屏障，重建免疫系統，達到“功能性治愈”和“完全治愈”的目的?！鞍亓植∪恕焙汀皞惗夭∪恕本褪抢谩疤烊弧盋CR5基因缺失（CCR5-Δ32）治愈艾滋病的典型范例。但由于這天然缺失在自然界概率少的可憐，因此，通過(guò)基因編輯敲除成體造血干細胞CCR5基因，再將編輯后的細胞移植到艾滋病患者體內成為了“功能性治愈”艾滋病的新策略。有必要強調的是，這里面提到的基因編輯技術(shù)的應用是以體細胞為靶標，與前一段時(shí)期報道的“賀建奎事件”中以生殖細胞和生殖為目的基因編輯CCR5基因，是完全不同的動(dòng)機和目標。
今天，《新英格蘭醫學(xué)雜志》（The New England Journal of Medicine）發(fā)表了由北京大學(xué)鄧宏魁研究組、解放軍總醫院第五醫學(xué)中心陳虎研究組及北京佑安醫院吳昊研究組合作，在基因治療艾滋病研究的重要成果。研究論文的題目是《利用CRISPR基因編輯的成體造血干細胞在患有艾滋病合并急性淋巴細胞白血病患者中的長(cháng)期重建》（CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia）。這是世界上首次報道通過(guò)基因編輯技術(shù)敲除人體造血干細胞CCR5基因，回輸給患有艾滋病及急性淋巴細胞白血病患者，在安全性和有效性等研究方面，獲得了寶貴的數據，取得了長(cháng)足的進(jìn)步，為我們進(jìn)一步完善利用基因編輯技術(shù)治療和治愈艾滋病提供了重要的參考和指導。
研究論文顯示，利用前期優(yōu)化的CRISPR/Cas9基因編輯造血干細胞技術(shù)，在供者來(lái)源的CD34+細胞上實(shí)現了17.8%的CCR5基因敲除效率。在移植后的19個(gè)月隨訪(fǎng)中，患者白血病處于完全緩解狀態(tài)，供者型細胞完全嵌合，骨髓細胞基因組能夠持續檢測到CCR5基因編輯。在探索治療艾滋病有效性方面，研究團隊暫停了抗艾滋病藥物治療。在停藥期間，外周血病毒載量從檢測不到反彈到每毫升3×107拷貝，CD4+ T細胞數量從每微升的575下降到250。而帶有CCR5敲除的CD4+ T細胞從2.96%增加到4.39%，相當于提高了1.5倍。提示CCR5基因編輯的T細胞具備抵御HIV的入侵的能力和一定程度的生存優(yōu)勢。此外，通過(guò)對患者移植后多個(gè)骨髓樣本的全基因組分析，并未發(fā)現基因編輯的脫靶效應和相關(guān)的副作用。
這些研究成果表明，成體造血干細胞基因編輯和移植，在艾滋病及急性淋巴細胞白血病患者體內具備良好的安全性和免疫重建的有效性。編輯后的成體造血干細胞能夠在患者體內實(shí)現長(cháng)期穩定的基因編輯效果，并重建人體造血系統。然而，對于艾滋病的治療效果與未經(jīng)過(guò)基因治療患者相比差別不大，主要反應在短暫的停藥期間，病毒反彈和CD4+ T細胞下降等方面。這種現象的發(fā)生，很有可能是移植的成體造血干細胞本身是CCR5基因野生型和敲除的混合體，其中帶有野生型CCR5基因的CD4+T細胞，為病毒的復制和反彈提供了場(chǎng)所。從這個(gè)意義上講，報道的病人更接近于“波士頓病人”的情況，突顯提高基因編輯效率的重要性。此外，在停藥期間，帶有CCR5敲除的CD4+ T細胞比例和數量都有所增加，也許真的驗證了人們所期待的那種敲除細胞面對艾滋病病毒感染的生存優(yōu)勢。由于病人隨后接受了抗病毒治療，對這個(gè)問(wèn)題的回答還需要進(jìn)一步的研究。再者，反彈病毒的來(lái)源一直是困擾研究領(lǐng)域的難題。如何在成體造血干細胞基因編輯和移植之前，清除患者體內的艾滋病病毒，防止嵌合免疫重建細胞感染，阻止病毒復制和反彈，同樣是提高治療效果的關(guān)鍵。
總之，今天的研究報告，為我們利用成體造血干細胞基因編輯和移植技術(shù)治療艾滋病提供了寶貴的信息和經(jīng)驗，對一些關(guān)鍵的結論和臨床表現，還需要對患者開(kāi)展長(cháng)期隨訪(fǎng)觀(guān)察。但是隨著(zhù)造血干細胞和誘導性多能干細胞（iPSC）研究的進(jìn)展，以及基因編輯技術(shù)和遞送效率的提高，我們有理由相信，新一代的基因編輯技術(shù)一定能夠在治療和治愈艾滋病的道路上發(fā)揮更大的作用。屆時(shí)，一定是對英年早逝的陳虎教授最好的追憶和懷念。
程臨釗（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫學(xué)學(xué)部講席教授，約翰霍普金斯醫學(xué)院終身教授）
中國人民解放軍307醫院（解放軍總醫院第五醫學(xué)中心）陳虎研究組、北京大學(xué)鄧宏魁研究組以及北京佑安醫院吳昊研究組合作，在《新英格蘭醫學(xué)雜志》（NEJM）剛剛發(fā)表了題為CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia的原創(chuàng )性研究論文。這篇短幅的文章是基于CRISPR編輯人的成體造血干細胞，對HIV-1的目標基因CCR5（共受體）進(jìn)行編輯，實(shí)現了基因編輯后的成體造血干細胞移植后在此病人（該患者同時(shí)患有艾滋病和急性淋巴細胞白血?。┰煅到y的重建。他們經(jīng)過(guò)仔細的檢測，并沒(méi)有看到脫靶或其它的遺傳相關(guān)的副作用。該工作探索了使用基因編輯在人成體干細胞中精準基因治療的可行性和安全性。相信這個(gè)剛剛發(fā)表的工作，會(huì )進(jìn)一步推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。CCR5也就是HIV-1入侵T細胞的共受體（鄧宏魁教授當年是共同發(fā)現者之一）。在過(guò)去30多年都是HIV-1 病毒和艾滋病研究的關(guān)注對象。很多研究者也都在考慮怎么去除CCR5的生物學(xué)活性，從而得到可以抵抗HIV-1 入侵的T細胞，在過(guò)去十多年里最為出名的“柏林病人”和“倫敦病人”，由于供體造血干細胞正好攜帶CCR5缺陷型突變，血清中的HIV病毒得到了有效的清除。但這種方法的可推廣性是有限的，其中一個(gè)原因是天然的，有CCR5缺陷的供體是極少數，尤其在亞洲人群里面。因此很多科學(xué)家都嘗試通過(guò)不同的方法，比如用基因編輯，人為去除CCR5的活性。此研究是用成年供者的造血干細胞，通過(guò)基因編輯的方法突變 （滅活）CCR5基因，再通過(guò)經(jīng)典的造血干細胞移植回輸給病人。此艾滋病病人同時(shí)患有急性淋巴細胞白血病需要行異體造血干細胞移植治療。所以在突變CCR5并做了移植后，移植的造血干細胞生產(chǎn)的T細胞就能夠抵抗HIV-1的入侵。這篇轉化型的研究在很多方面都做得很出色。第一個(gè)是遵守了醫學(xué)倫理，有病人知情同意書(shū)，在按照國際規范做的很好；第二方面，在技術(shù)上也把他們過(guò)去幾年，尤其是鄧宏魁團隊在過(guò)去數年中采用基因編輯的新技術(shù)，如非病毒的方法，把關(guān)鍵的蛋白和guideRNA的復合體，通過(guò)電轉的方法輸進(jìn)人的造血干細胞。這樣避免了外源DNA的引入，更沒(méi)有插入干細胞的染色體里面, 在干細胞里面也降低了存在的脫靶效應。重要的是，此研究用人的成體造血干細胞做基因編輯. 雖然靶向基因也是CCR5，但是同去年被媒體大肆報道的賀建奎博士做的事有很大的不一樣。賀建奎博士采用的是人的受精卵,最終產(chǎn)生基因修飾的嬰兒。這樣人體生殖系和體細胞系所有的細胞都會(huì )有CCR5突變。雖然CCR5 基因滅活的初衷是，嬰兒的T細胞應該抵抗HIV-1 的入侵和進(jìn)一步感染，但CCR5 基因滅活是否會(huì )對胚胎和成體細胞生理活性和功能的可能影響，現在不太明了。公開(kāi)報道的賀建奎工作，眾所周知，有很多瑕疵和違規行為。目前具體細節還在進(jìn)一步的調查，但科學(xué)界和社會(huì )普遍譴責賀的以人類(lèi)生殖為目的基因編輯工作。這篇剛在NEJM上發(fā)表的工作，本質(zhì)上是與賀的公共場(chǎng)合和媒體上報告不同。這次剛發(fā)表的工作，是在人的成體造血干細胞中做CCR5 的基因修飾。人類(lèi)造血干細胞移植已經(jīng)用了50多年，基本上在全世界不管歐美國家還是在中國都沒(méi)有什么爭議。這項技術(shù)已經(jīng)治愈和幫助了無(wú)數病人。此工作進(jìn)一步使用基因編輯，完善基因和細胞治療，使像這一類(lèi)的絕癥病人也能夠得到有效的根治。最后我想說(shuō)的是，此文章最后一位作者也是共同通訊作者陳虎教授是中國造血干細胞領(lǐng)域的優(yōu)秀人物，在此研究中起到關(guān)鍵的作用，只是不幸的是陳虎教授在此文章修訂期間英年早逝。這篇文章的發(fā)表也是對陳虎教授最好的懷念。
陳虎教授（1962-2019），全軍造血干細胞移植中心主任、全軍造血干細胞研究所所長(cháng)、血液病專(zhuān)業(yè)委員會(huì )副主任，曾牽頭的“成體干細胞救治放射損傷新技術(shù)的建立與應用”獲得國家科技進(jìn)步一等獎，“間充質(zhì)干細胞在急性放射病干細胞移植中誘導免疫耐受的研究”獲得軍隊科技進(jìn)步一等獎，2016年獲得“何梁何利基金科學(xué)與技術(shù)進(jìn)步獎”。曾榮立一等功1次、二等功1次、三等功1次。姜錫娟 攝影
現在，國內外有很多研究者進(jìn)一步推動(dòng)和完善基因編輯在臨床上的應用。除了艾滋病以外，此方法可用于其他血液和免疫系統的疾病治療，比如在國內比較常見(jiàn)的血友病和地中海貧血等。此篇文章的發(fā)表也會(huì )有助于其他團隊進(jìn)一步完善相關(guān)技術(shù)。此研究除了艾滋病以外，對其他用造血干細胞治療的血液和免疫相關(guān)的疾病，都將會(huì )帶來(lái)新的推動(dòng)。
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