CRISPR-Cas9系統需要與靶標相鄰的PAM序列以促進(jìn)Cas9酶識別和結合至該位點(diǎn)（CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對，另一部分是Cas9蛋白和一個(gè)短DNA序列，這個(gè)短的 DNA序列通常在靶DNA的3'末端發(fā)現，被稱(chēng)為protospacer adjacent motif，PAM）。

目前， SpCas9（ 來(lái)自Streptococcus pyogenes）和SaCas9（來(lái)自Streptococcus aureus）所識別的PAM序列多含鳥(niǎo)嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已報導的堿基編輯系統無(wú)法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）區域進(jìn)行精準堿基編輯操作。特別是最常用的SpCas9酶需要GG PAM序列進(jìn)行識別，以至于其作用限制僅為基因組的9.9％，靶向區域十分局限。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究小組開(kāi)發(fā)了一種名為SPAMALOT（Search for PAMs by Alignment of Targets）的分析軟件（通過(guò)目標隊列來(lái)搜索PAM），對細菌基因組進(jìn)行生物信息學(xué)搜索，以尋找是否存在任何具有限制性較低的PAM的Cas9樣酶序列。然后，他們從生物信息學(xué)搜索中創(chuàng )建出最佳匹配的合成版本，并評估了它們在CRISPR系統中的效用。

他們發(fā)現了一種特別有效的酶ScCas9，與SpCas9有著(zhù)驚人的相似之處，來(lái)自 Streptococcus canis bacteria。有別于雙G PAM識別，ScCas9僅需1 個(gè)G的PAM序列，這使其在基因組中的靶區域明顯大于SpCas9，可以靶向將近50%的基因組區域，研究成果發(fā)表在《Science Advances》雜志。

“這種酶看起來(lái)幾乎與最初發(fā)現的酶相同......但它能夠靶向常用酶不能的DNA序列，”共同主要作者麻省理工學(xué)院Pranam Chatterjee這么解釋。

ScCas9的發(fā)現為基因治療帶來(lái)新希望

過(guò)去CRISPR系統無(wú)法到達的特異性突變，采用ScCas9后或將迎來(lái)轉機。例如，基因的典型長(cháng)度大約為1000個(gè)堿基，如果治病目標是敲除單基因的多個(gè)不同位置，研究人員可能更傾向選擇簡(jiǎn)單地敲除整個(gè)基因。但是，像鐮狀細胞性貧血這種單一堿基突變引起的疾病，ScCas9酶可以更精確地加以校正。“堿基編輯可不是隨意在1000個(gè)堿基上打靶，然后亂敲一氣，”Jacobson說(shuō)。“你需要去到非常精確的位置，把CRISPR機器放在它旁邊，然后給它一個(gè)堿基編輯器（另一個(gè)與CRISPR相連的蛋白質(zhì)），進(jìn)去修理或改變堿基。”

新工具在這種情況下特別有用。法國國家自然歷史博物館的CRISPR專(zhuān)家Jean-Paul Concordet（未參與本研究）評價(jià)：他們完美地利用了鏈球菌Cas9序列的自然進(jìn)化，開(kāi)辟了新基因組編輯工具挖掘的有力途徑。

ScCas9與SpCas9共享89.2％的序列相似性，這表明將其整合到CRISPR-Cas9編輯系統的當前模型中應該不太困難。 “ScCas9的氨基酸序列與SpCas9的氨基酸序列密切相關(guān)，因此預期它也很容易以重組形式生產(chǎn)，并且有望應用于SpCas9的所有應用。”

“此外，ScCas9使用與SpCas9相同的引導RNA，因此來(lái)自不同公司的合成引導RNA可以通用。”

該研究的下一步是繼續尋找更多的酶，這些酶可以增加CRISPR系統的靶標范圍，同時(shí)保持其準確性。與此同時(shí)，Chatterjee熱情推薦其他人能夠在自己的研究中充分利用新酶：“我們很高興ScCas9能夠進(jìn)入基因組編輯應用家族，并希望獲得有關(guān)它們的反饋。”