《實(shí)驗用斑馬魚(yú)飼育技術(shù)條件》通過(guò)江蘇省地方標準審核
發(fā)布時(shí)間:
2020-12-14
ICS 07.080
CCS A40/49
32
江蘇省 地 方 標 準
DB 32 XXXXX
—
2020
實(shí)驗用 斑馬魚(yú) 飼育技術(shù)條件
Technical requirements for breeding laboratory zebrafish
2020
-
XX
-
XX 發(fā)布 2020
-
XX
-
XX 實(shí)施
江蘇省市場(chǎng)監督管理局 發(fā) 布Q/LB.
□XXXXX
-
XXXX
I
目 次
前言
................................................................................ III
1 范圍
............................................................................... 1
2 規范性引用文件
..................................................................... 1
3 術(shù)語(yǔ)和定義
......................................................................... 1
4 飼育魚(yú)房工藝布局
................................................................... 1
4.1 飼育魚(yú)房總體要求
............................................................... 1
4.2 飼育魚(yú)房功能分區
............................................................... 2
5 飼育設施
........................................................................... 2
5.1 流水飼育系統
................................................................... 2
5.2 靜水飼育系統
................................................................... 3
6 飼育環(huán)境條件
....................................................................... 3
6.1 溫度
........................................................................... 3
6.2 濕度
........................................................................... 3
6.3 空氣
........................................................................... 3
6.4 環(huán)境噪音
....................................................................... 3
6.5 光照
........................................................................... 3
6.6 飼育用水
....................................................................... 4
6.7 流水循環(huán)速度
................................................................... 4
6.8 日換水量
....................................................................... 4
7 飼育密度與餌料及飼喂
............................................................... 4
7.1 飼育密度
....................................................................... 5
7.2 飼育餌料
....................................................................... 5
7.3 飼喂
........................................................................... 5
8 繁育和遺傳資源保存
................................................................. 5
8.1 繁育安排
....................................................................... 5
8.2 新創(chuàng )制遺傳資源保存
............................................................. 5
9 倫理維護
........................................................................... 6
9.1 福利保障
....................................................................... 6
9.2 飼育人員技能
................................................................... 6
9.3 生長(cháng)記錄
....................................................................... 6
9.4 標識
........................................................................... 6
9.5 安樂(lè )死
......................................................................... 6
10 質(zhì)量規范
.......................................................................... 6
10.1 實(shí)驗用斑馬魚(yú)來(lái)源
.............................................................. 6
10.2 胚胎的質(zhì)量
.................................................................... 6
10.3 仔魚(yú)的質(zhì)量
.................................................................... 6
10.4 幼魚(yú)與成魚(yú)的質(zhì)量
.............................................................. 6DB 32 XXXXX
—
2020
附錄 A（資料性） 草履蟲(chóng)培育
...........................................................8
附錄 B（資料性） 豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)孵化及脫鹽處理..............................................9
參考文獻
..............................................................................10
IIQ/LB.
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-
XXXX
III
前 言
本文件按照GB/T 1.1
—
2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定
起草。
請注意本文件的某些內容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專(zhuān)利的責任。
本文件由江蘇省實(shí)驗動(dòng)物標準化專(zhuān)業(yè)技術(shù)委員會(huì )提出并歸口。
本文件起草單位：南京堯順禹生物科技有限公司。
本文件主要起草人：趙慶順、池軍、王明開(kāi)、張瓊。Q/LB.
□XXXXX
-
XXXX
1
實(shí)驗用 斑馬魚(yú) 飼育技術(shù)條件
1 范圍
本文件規定了《實(shí)驗用 斑馬魚(yú) 飼育技術(shù)條件》的飼育魚(yú)房工藝布局、飼育設施、飼育環(huán)境條件、
飼育密度與餌料及飼喂、繁育和遺傳資源保存、倫理維護以及質(zhì)量規范。
本文件適用于實(shí)驗用斑馬魚(yú)的飼育。
2 規范性引用文件
下列文件中的內容通過(guò)文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，
僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本
文件。
GB 5749 生活飲用水衛生標準
GB/T 18883 室內空氣質(zhì)量標準
GB/T 31962 污水排入城鎮下水道水質(zhì)標準
3 術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
3.1
斑馬魚(yú)胚胎 zebrafish embryo
未出殼膜的斑馬魚(yú)胚胎，
一
般指0 dpf
~
3 dpf（days post fertilization；受精后天數）的斑馬魚(yú)
胚胎。
3.2
斑馬魚(yú)仔魚(yú) zebrafish larva
出殼膜后至發(fā)育到未成為幼魚(yú)之前的斑馬魚(yú)，
一
般指4 dpf
~
28 dpf的斑馬魚(yú)。
3.3
斑馬魚(yú)幼魚(yú) juvenile zebrafish
外部形態(tài)與成魚(yú)相似但未性成熟的斑馬魚(yú)，
一
般指 29 dpf
~
84 dpf的斑馬魚(yú)。
3.4
成年斑馬魚(yú) adult zebrafish
性成熟、具備繁殖能力的斑馬魚(yú)。
一
般指年齡大于84 dpf的斑馬魚(yú)。
4 飼育魚(yú)房工藝布局
4.1 飼育魚(yú)房總體要求
獨立空間，凈高度不宜低于250 cm；地面防潮、防水、防滑、耐沖擊、平整；墻壁光滑、耐潮、不
吸水、抗擊碰性損壞、無(wú)縫隙。DB 32 XXXXX
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4.2 飼育魚(yú)房功能分區
包括去離子水制備區、循環(huán)系統流水處理區、飼育區、餌料生產(chǎn)區、儲存區、清潔區、隔離區和實(shí)
驗區。
4.2.1 去離子水制備區
將符合GB 5749《生活飲用水衛生標準》要求的水進(jìn)行反滲處理制備成去離子水的區域，可位于飼
育魚(yú)房外獨立空間。
4.2.2 循環(huán)系統流水處理區
對飼育用水進(jìn)行過(guò)濾、紫外消毒、充氣、pH調節和電導率調節等集中區，可獨立于飼育魚(yú)房外。
4.2.3 飼育區
日常繁育斑馬魚(yú)的飼育區應配備流水飼育設施飼育仔魚(yú)、幼魚(yú)與成年魚(yú)；配備靜水飼育設施飼育胚
胎、仔魚(yú)以及用于親魚(yú)繁育。
4.2.4 餌料生產(chǎn)區
包括培育開(kāi)口餌料草履蟲(chóng)的草履蟲(chóng)生產(chǎn)區和孵化豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)的豐年蟲(chóng)卵孵化區。分別配置供培育
草履蟲(chóng)的容器和供孵化豐年蟲(chóng)卵的專(zhuān)用孵化設備。
4.2.5 儲存區
配備冰箱存放斑馬魚(yú)餌料。
4.2.6 清潔區
設有清潔用水池以及魚(yú)撈等漁具存放區。
4.2.7 隔離區
外來(lái)的斑馬魚(yú)應飼養在獨立于日常繁育飼育區之外的隔離區，胚胎經(jīng)消毒處理后方可進(jìn)入日常繁
育飼育區。
4.2.8 實(shí)驗區
4.2.8.1 進(jìn)行實(shí)驗處理的斑馬魚(yú)應飼育在獨立于斑馬魚(yú)日常繁育飼育區外的實(shí)驗區，可位于飼育魚(yú)
房外的實(shí)驗室內。
4.2.8.2 僅為完成遺傳改造而實(shí)施過(guò)顯微注射的斑馬魚(yú)胚胎或僅用于簡(jiǎn)單顯微形態(tài)學(xué)觀(guān)測以評估
質(zhì)量的斑馬魚(yú)可回到日常繁育飼育區。
4.2.8.3 所有經(jīng)實(shí)驗處理的斑馬魚(yú)（包括胚胎、仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)）不應回到日常繁育飼育區。完
成實(shí)驗后通常需要進(jìn)行安樂(lè )死。
5 飼育設施
5.1 流水飼育系統
5.1.1 飼育架
2Q/LB.
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-
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應由不銹鋼或其它防水防銹等無(wú)毒材料制成，層距不低于35 cm。
5.1.2 飼育缸
5.1.2.1 材質(zhì)要求無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)放射性、耐腐蝕、耐高溫、耐高壓、耐沖擊、易清洗、易消毒滅
菌。
5.1.2.2 飼育缸由飼育蓋板、飼育缸體以及飼育后插板組成。
5.1.2.3 飼育蓋板設餌料投喂孔、流水單管孔和備用孔。
5.1.2.4 飼育缸體配有雙卡槽，可同時(shí)插入防仔魚(yú)和幼魚(yú)逃逸后插板以及導污后插板。
5.1.3 循環(huán)凈化設備
包括過(guò)濾處理單元、水體循環(huán)設備、消毒單元、充氣補氧單元、PLC自動(dòng)化控制集成單元、給排水
分配單元、生物凈化水槽、系統流量監控單元、pH控制單元和電導率控制單元。
5.2 靜水飼育系統
5.2.1 飼育架
同5.1.1。
5.2.2 交配缸
內外膽結構，材料要求與飼育缸（5.1.2）
一
致；內膽底部高于外盒底部2 cm，并配有分離隔板和
蓋板。
5.2.3 飼育缸
同5.2.2，但無(wú)內膽和分離隔板。
6 飼育環(huán)境條件
6.1 溫度
室溫23 ℃
~
30 ℃，24 h內變動(dòng)不超過(guò)?2.5 ℃。水溫25 ℃
~
29 ℃，24 h內變動(dòng)不超過(guò)?1.0 ℃。
6.2 濕度
相對濕度為45%
~
70%。
6.3 空氣
空氣質(zhì)量符合GB/T 18883《室內空氣質(zhì)量標準》。另需有新風(fēng)輸入，至少每4 h
~
5 h 輸入1次，每
次空氣交換量是整體空間的2倍體積。
6.4 環(huán)境噪音
低于70 dB。
6.5 光照
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采用14 h光照10 h黑暗的方式飼養。光照時(shí)間內，飼育魚(yú)房?jì)群汪~(yú)缸水面光照強度均為54 lx
~
324
lx。
6.6 飼育用水
6.6.1 電導率
450 μS/cm
~
550 μS/cm。
6.6.2 pH
pH 6.5
~
pH 8.0。
6.6.3 氨氮
含量＜0.02 mg/l。
6.6.4 鹽度
含量為0.3‰
~
0.5‰。
6.6.5 亞硝酸鹽
含量＜0.2 mg/l。
6.6.6 硝酸鹽
含量＜5 mg/l。
6.6.7 溶解氧
含量為5 mg/l
~
8 mg/l。
6.6.8 二氧化碳
含量為＜5 mg/l。
6.6.9 硬度
50 mg/l
~
100 mg/l。
6.7 流水循環(huán)速度
小于10 dpf的仔魚(yú)所在魚(yú)缸的水流速度應小于10 ml/min，10 dpf至28 dpf仔魚(yú)所在魚(yú)缸的水流速
度為50 ml/min
~
80 ml/min，幼魚(yú)和成魚(yú)魚(yú)缸水流速度100 ml/min
~
150 ml/min。
6.8 日換水量
6.8.1 日排水量為系統總水量的 2%
~
10%，根據系統中所負荷魚(yú)量適當增加。
6.8.2 日常繁育斑馬魚(yú)的飼育用水符合 GB/T 31962《污水排入城鎮下水道水質(zhì)標準》，可直接排
入城鎮下水道。
6.8.3 實(shí)驗區內用于斑馬魚(yú)實(shí)驗處理的飼育用水應按照生物類(lèi)實(shí)驗室的要求處理，不應直接排入
城鎮下水道。
7 飼育密度與餌料及飼喂
4Q/LB.
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7.1 飼育密度
7.1.1 胚胎飼育密度
10 ml飼育用水飼育的胚胎數不超過(guò)50 枚。
7.1.2 仔魚(yú)飼育密度
4 dpf
~
17 dpf仔魚(yú)的飼育密度不超過(guò)40 尾/l、大于18 dpf的仔魚(yú)飼育密度不超過(guò)20 尾/l。
7.1.3 幼魚(yú)飼育密度
不超過(guò)6 尾/l。
7.1.4 成魚(yú)飼育密度
5 尾/l。
7.2 飼育餌料
7.2.1 斑馬魚(yú)餌料包括草履蟲(chóng)活體和豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)活體，可自行培育或購買(mǎi)。
7.2.2 草履蟲(chóng)培育方法見(jiàn)附錄 A。培育出的草履蟲(chóng)活體直接用于斑馬魚(yú)仔魚(yú)的飼喂。
7.2.3 豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)孵化方法見(jiàn)附錄 B。孵化出的幼蟲(chóng)經(jīng)脫鹽處理后用于斑馬魚(yú)的飼喂。
7.3 飼喂
7.3.1 飼喂總則
斑馬魚(yú)的每日飼喂次數為2次
~
4次。
7.3.2 飼喂量
7.3.2.1 發(fā)育時(shí)期為 4 dpf
~
6 dpf 仔魚(yú)，每次按草履蟲(chóng) 1×10
5
個(gè)/l
~
3×10
5
個(gè)/l 投喂。發(fā)育時(shí)期
為 7 dpf
~
10 dpf 仔魚(yú)，以草履蟲(chóng)和豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)混合喂飼，草履蟲(chóng)每次投喂密度為 3×10
5
個(gè)/l
~
5×10
5
個(gè)/l，豐年蟲(chóng)為 1×10
4
個(gè)/l
~
4×10
4
個(gè)/l，依發(fā)育時(shí)間逐步提高豐年蟲(chóng)比例。發(fā)魚(yú)時(shí)期為
11 dpf
~
28 dpf 仔魚(yú)，以豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)飼喂，飼喂量為約 3×10
4
個(gè)/l
~
4×10
4
個(gè)/l。
7.3.2.2 幼魚(yú)每次投喂豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng) 5×10
4
個(gè)/l
~
9×10
4
個(gè)/l。
7.3.2.3 成魚(yú)每次投喂豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng) 1×10
5
個(gè)/l
~
3×10
5
個(gè)/l。
8 繁育和遺傳資源保存
8.1 繁育安排
使用交配缸進(jìn)行斑馬魚(yú)交配繁育。親本的雌雄比例為雌2尾?雄1尾
~
2尾，
一
個(gè)交配缸內最多不超過(guò)7
尾魚(yú)。
8.2 新創(chuàng )制遺傳資源保存
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根據國家斑馬魚(yú)資源中心的要求填寫(xiě)相關(guān)表格，向國家斑馬魚(yú)資源中心遞交新創(chuàng )制的基因組改造
的詳細遺傳信息；同時(shí)遞交新創(chuàng )制的基因型和遺傳背景明確的斑馬魚(yú)成魚(yú)，用于國家斑馬魚(yú)資源中心保
存。
9 倫理維護
9.1 福利保障
應制定斑馬魚(yú)使用與管理的具體規章制度；不應執行任何不符合動(dòng)物倫理學(xué)規范的斑馬魚(yú)使用與
管理方案。
9.2 飼育人員技能
斑馬魚(yú)生產(chǎn)與使用人員應在上崗前接受專(zhuān)業(yè)培訓，了解斑馬魚(yú)繁殖生物學(xué)的基本知識、飼育規范以
及使用與管理規范等。
9.3 生長(cháng)記錄
記錄每日的水溫、室溫、濕度、飼喂、清潔、整理、魚(yú)缸清洗、受精卵收集、草履蟲(chóng)飼育和豐年蟲(chóng)
幼蟲(chóng)孵化情況等。
9.4 標識
黏貼在飼育缸或交配缸外的斑馬魚(yú)標簽的信息應包括：動(dòng)物的受精日期、基因型和傳代代數等內容。
9.5 安樂(lè )死
將斑馬魚(yú)置于冰水混合物中快速預冷2 min后，放入
-
20 ℃冰箱凍存。斑馬魚(yú)安樂(lè )死后應及時(shí)轉移
至飼育魚(yú)房外的專(zhuān)用斑馬魚(yú)尸體存放冰箱的冷凍室中凍存，集中進(jìn)行無(wú)害化處理。
10 質(zhì)量規范
10.1 實(shí)驗用斑馬魚(yú)來(lái)源
實(shí)驗用斑馬魚(yú)的遺傳背景應該明確。不應飼育遺傳背景不明的斑馬魚(yú)；不應使用來(lái)源于寵物市場(chǎng)的
斑馬魚(yú)。
10.2 胚胎的質(zhì)量
應具備與發(fā)育時(shí)期
一
致的正常的顯微形態(tài)學(xué)特征。
10.3 仔魚(yú)的質(zhì)量
10.3.1 應從殼膜中孵出，具正常的顯微形態(tài)學(xué)特征，可在水中自由游泳。
10.3.2 4 dpf 仔魚(yú)魚(yú)鰾的后部腔室開(kāi)始充氣。約 20 dpf，仔魚(yú)魚(yú)鰾的前部腔室開(kāi)始充氣。約
21 dpf 時(shí)，魚(yú)鰾前后兩個(gè)腔室的充氣完成。
10.4 幼魚(yú)與成魚(yú)的質(zhì)量Q/LB.
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XXXX
10.4.1 健康的斑馬魚(yú)應保持充分放松的姿態(tài)以與水面平行的方式在水中游泳。
10.4.2 斑馬魚(yú)的正常行為包括均勻的呼吸（通過(guò)活動(dòng)鰓蓋）、以及保持對游泳和捕食運動(dòng)的興趣。
10.4.3 斑馬魚(yú)生病的特征包括體重與體長(cháng)的比例下降、急促的呼吸、明顯的身體組織的損傷（潰
瘍、外傷）、以及體色、體型和運動(dòng)方式等的改變。當斑馬魚(yú)急速翻身、向
一
側傾斜、或者與水面
垂直也可以作為生病的特征。
10.4.4 表現出異于正常斑馬魚(yú)行為的基因組改造斑馬魚(yú)突變體，不應視作病魚(yú)。
10.4.5 生病的斑馬魚(yú)通常要進(jìn)行及時(shí)的安樂(lè )死。
10.4.6 如果病魚(yú)十分珍貴，可將病魚(yú)轉移至隔離區隔離治療。
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A
A
附 錄 A
（資料性）
草履蟲(chóng)培育
在3 l缸中加入0.1 g 氯化鈉（分析純）和約5粒大麥粒，倒入1.5 l
~
2 l 煮沸去離子水后混勻，放
置室溫待用，待溶液降至室溫后加入0.1 g酵母粉搖勻備用，吸取母液10%作為種子液，加入混合好的新
鮮培養液中，室溫下培養1周，于體視顯微鏡下檢測培養效果，
一
般可達到2,000 個(gè)/ml的草履蟲(chóng)，此時(shí)
可直接使用。3周
~
4周后需利用種子液，再行培養新鮮草履蟲(chóng)。Q/LB.
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B
B
附 錄 B
（資料性）
豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)孵化及脫鹽處理
豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)是通過(guò)購買(mǎi)市售的豐年蟲(chóng)休眠卵孵化而來(lái)。孵化使用符合GB 5749《生活飲用水衛生標
準》要求的市政自來(lái)水配制的溶液完成。孵化溶液含鹽量（使用50目以下的細海鹽或孵化專(zhuān)用海鹽）為
1.5%
~
2.5%；pH 8.0
~
pH 8.2（使用NaHCO3調節pH）；蟲(chóng)卵密度為3 g/l；孵化溫度為25 ℃
~
30 ℃；孵化
時(shí)間為24 h
~
30 h。
孵化時(shí)，位于溶液底部設有充氣裝置，保證豐年蟲(chóng)休眠卵處于懸浮狀態(tài)。
孵化完成后，拔去充氣管，靜置沉降10 min
~
15 min，此時(shí)豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)會(huì )沉至孵化器下部，打開(kāi)孵
化器下部閥門(mén)即可收集孵化出的豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)。但此時(shí)因為鹽度太高還不能直接投喂，需要通過(guò)同樣的靜
置沉降的方法再將收集到的豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)用去離子水或流水系統飼育用水洗滌4 次后，方可投喂斑馬魚(yú)。DB 32 XXXXX
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參考文 獻
[1] 廣東實(shí)驗動(dòng)物監測所、中國科學(xué)院水生生物研究所、中國水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所、上海實(shí)
驗動(dòng)物研究中心、中國醫學(xué)科學(xué)院醫學(xué)實(shí)驗動(dòng)物研究所聯(lián)合編制，2017。國家標準《實(shí)驗動(dòng)物魚(yú)類(lèi)環(huán)境
與質(zhì)量控制》（征求意見(jiàn)稿）（含實(shí)驗用魚(yú) 第1部分：遺傳質(zhì)量控制；第二部分：病原學(xué)等級及監測；
第3部分：飼料；第4部分：環(huán)境條件）。2017年7月4日公示。
[2] 北京市質(zhì)量技術(shù)監督局，2014。北京市地方標準 DB11/T 1053.1
-
2013《實(shí)驗用魚(yú) 第1部分：
微生物學(xué)等級及監測》、DB11/T 1053.2
-
2013《實(shí)驗用魚(yú) 第2部分：寄生蟲(chóng)學(xué)等級及監測微生物學(xué)等級
及監測》、DB11/T 1053.3
-
2013《實(shí)驗用魚(yú) 第3部分：遺傳質(zhì)量控制》、DB11/T 1053.4
-
2013《實(shí)驗用
魚(yú) 第4部分：病理學(xué)診斷規范遺傳質(zhì)量控制》、DB11/T 1053.5
-
2013《實(shí)驗用魚(yú) 第5部分：配合飼料技
術(shù)要求》、DB11/T 1053.6
-
2013《實(shí)驗用魚(yú) 第6部分：環(huán)境條件》。北京市質(zhì)量技術(shù)監督局2013
-
12
-
20
發(fā)布，2014
-
04
-
01實(shí)施。
[3] 農業(yè)部，2017。病死及病害動(dòng)物無(wú)害化處理技術(shù)規范。2017年7月3日發(fā)布。
[4] Jolaine, M.W.
, Ralph, M.B.
, Carty A.
J
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